Nuôi cấy tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cells-MSC) máu cuống rốn lớp đơn in vitro

Tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cells-MSC) là các tế bào gốc đa năng, có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào xương, sụn, cơ, mỡ, thần kinh và tế bào beta của tụy đảo…(Phan Kim Ngọc, 2009)

Trong cơ thể người trưởng thành các tế bào MSC có mặt trong nhiều mô khác nhau, chúng có khả năng tạo ra các loại tế bào đảm nhận các chức năng chuyên biệt tại mô đó. Tế bào MSC thường được thu nhận từ tủy xương và tế bào nền tủy. Tuy nhiên, chúng cũng được thu nhận từ mô mỡ, màng xương, máu, tủy xương… và gần đây là cuống rốn.

Với sự khám phá mang tính chất cách mạng của PGS.TS Phan Toàn Thắng (2004) về tế bào gốc máu cuống rốn đã giải quyết được nhiều vấn đề còn đang gây tranh cãi Nguồn tế bào gốc này vượt trội hơn so với tế bào gốc phôi hay tế bào gốc trưởng thành bởi những ưu điểm: tính kháng nguyên tương hợp mô biểu hiện thấp, tránh được hiện tượng đào thải miễn dịch. Chúng có sức sống và phát triển mạnh mẽ khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp và tiềm năng biệt hoá cao, không gặp phải vấn đề về y đạo đức… Tế bào MSC máu cuống rốn đã được biệt hoá thành nhiều loại tế bào, dùng trong các liệu pháp chữa trị các bệnh như biệt hoá thành tế bào xương trong ghép xương, tế bào giác mạc trong ghép giác mạc…

Gần đây, tế bào gốc trung mô máu cuống cũng được nuôi cấy khá phổ biến tại các phòng thí nghiệm của Việt Nam, đặc biệt là phòng thí nghiệm tế bào gốc tại trường Khoa học tự nhiên.. Các công trình nghiên cứu chủ yếu là thiết lập quy trình nuôi cấy, khảo sát sự tăng trưởng và sự biệt hóa thành tế bào xương, sụn, mỡ,…

Nuôi cấy tế bào gốc trung mô

1. Điều kiện nuôi cấy
Những yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào MSC :
–  Giá thể nuôi cấy
–  Thành phần hoá lí và sinh lí của môi trường nuôi cấy
–  Thành phần pha khí
–  Nhiệt độ tối ưu khi nuôi cấy

1.1. Giá thể nuôi cấy
Do  tế  bào động  vật không  có vách như  tế  bào  thực  vật và vi  sinh vật  nên chúng cần một giá thể để có thể trải rộng ra trong suốt quá trình tăng sinh. Với các tế bào bình thường, khi nuôi cấy chúng thường chỉ mọc thành lớp đơn và phủ kín bề mặt giá  thể.
Các giá  thể  thông  thường bao gồm đĩa, bình nuôi bằng nhựa được sử dụng phổ biến, chúng  có hai ưu điểm: (1) giá thể có bề mặt phù hợp cho tế bào gắn bám và thấm được CO2 và O2; (2) bề mặt bằng nhựa mỏng, thích hợp cho việc quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học hay điện tử.

1.2. Pha khí
Thành phần quan trọng của pha khí là CO2 và O2.
Trong nuôi cấy, áp lực oxy ở điều kiện khí quyển phù hợp cho hầu hết các tế bào nuôi cấy. Độ sâu  (bề dày) của môi  trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến  tỉ  lệ oxy khuyếch tán vào tế bào, thông thường độ sâu tối ưu của môi trường vào khoảng 2 – 5 mm (0,2 – 0,5 ml/cm2) trong nuôi cấy tĩnh (Đặng Thị Tùng Loan, 2007).
Vai trò của khí carbonic trong nuôi cấy tế bào MSC nói riêng và tế bào động vật nói chung khá là phức tạp, do nhiều hoạt động tương hỗ giữa CO2 hoà tan, pH và nồng độ HCO3. Hệ  đệm  bicarbonat  giúp  duy  trì  pH mong muốn. Sản  phẩm  nuôi  cấy  chứa nhiều acid do CO2 nội sinh cao, nắp của bình nuôi cấy cho phép CO2 thừa được thải ra ngoài đồng  thời CO2  từ  tủ nuôi sẽ đi vào đệm cho môi  trường. Mỗi hệ đệm có nồng độ CO2 thích hợp phụ thuộc vào từng loại môi trường dùng để nuôi cấy tế bào (Phan Kim Ngọc, 2006).
Ví dụ: môi trường D’MEM đệm tốt với 5% CO2.

1.3. Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy phụ thuộc vào nhiệt độ cơ thể của vật thí nghiệm và vùng cơ thể thu nhận tế bào. Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy tế bào người và động vật máu nóng là 37oC. Tế bào MSC sau khi  thu nhận  từ  tuỷ xương chuột được nuôi  trong  tủ ấm ở nhiệt độ 37o C, 5% CO2.

1.4. pH
pH 7,4 – 7,7  là  tốt nhất cho việc nuôi cấy  tế bào,  trong đó có  tế bào MSC. Phenol  red  được  dùng  như  chất  chỉ  thị  pH. Có  thể  bổ  sung  Phenol  red  vào môi trường nuôi cấy để dễ dàng theo dõi sự thay đổi pH của mẫu.
Phenol red có màu đỏ ở pH 7,4; cam ở pH 7; vàng ở pH 6,5; vàng chanh ở pH < 6,5; hồng ở pH 7,6 và tím ở pH 7,8.

1.5. Dung dịch đệm
Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường luôn thay đổi, do:
+ Ở các đĩa mở, CO2 giải phóng làm tăng pH.
+ Các dòng tế bào nuôi cấy ở mật độ cao thường sản sinh nhiều CO2 và acid lactic làm giảm pH.
Do đó, môi trường nuôi cấy phải được đệm. Các hệ đệm thường được sủ dụng trong nuôi cấy gồm: bicarbonate, N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane (HEPES), …(Đặng Thị Tùng Loan, 2007).

2.  Môi trường và thành phần các chất trong nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với nuôi cấy vi sinh hay tế bào thực vật, chúng là hỗn hợp các yếu tố dinh dưỡng và các chất khác. Các công trình nghiên cứu đầu tiên về nuôi cấy tế bào động vật thường dung hỗn hợp dung dịch muối sinh lí, huyết thanh và chế phẩm phôi gà làm môi trường. Do thành phần của chúng phức tạp, khó ổn định, nên người ta quan tâm dần đến việc nghiên cứu, tạo các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh và ổn định thành phần trong những môi trường nuôi cấy khác nhau (Phan Kim Ngọc, 2006). Tùy theo từng loại tế bào khác nhau mà dung môi trường thích hợp.
Thành phần môi  trường nuôi cấy  tế bào được  thiết  lập gần giống như  thành phần  dịch  lỏng  trong  cơ  thể  sống  bao  gồm muối vô cơ,  carbonhydrate,  vitamin,  amino acid, các tiền chất biến dưỡng, nhân tố tăng trưởng, hormone, các yếu tố vi lượng và đặc biệt quan trọng là huyết thanh. Các chất dinh dưỡng thiết yếu giúp tế bào phân chia như amino acid, acid béo, đường, các ion, các vitamin, cofactor và các phân tử cần thiết để duy trì môi trường hóa học cho các tế bào (Phan Kim Ngọc, 2006).
Môi  trường  dùng  để  nuôi  cấy  MSC  thông  thường  là  Eagle Minimal Essential Media (MEM) (Eagle, 1959) hoặc Dulbecco’s Modified Eagle’s media (D’MEM) (Dulbecco và Freeman, 1959).
Môi trường Eagle Minimal Essential Media (MEM) còn gọi là môi trường tối thiểu, do Eagle thiết lập. Đây là môi trường cơ bản có chứa nồng độ các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5- 10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào
Môi trường D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) do Dulbecco cải tiến từ môi trường E’MEM (Eagle’s Minimal Essential Medium) hiện đang được sử dụng chủ yếu  trong việc nuôi cấy  tế bào, đặc biệt  là  tế bào gốc. Nó có nồng độ amino acid cao gấp đôi, nồng dộ vitamin cao gấp bốn môi  trường E’MEM,  tối ưu cho nuôi cấy tế bào có mật độ cao. Chính vì vậy mà D’MEM là môi trường thương phẩm thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật.
Vai trò của huyết thanh bào thai bò (FBS) trong việc tăng sinh và duy trì tiềm năng biệt hoá cho cả tế bào người và động vật là rất quan trọng.Hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới đều sử dụng các phương pháp thu nhận và  tăng sinh  tế bào MSC dựa vào  tính bám dính của chúng vào bề mặt nhựa được thiết kế đặc biệt, và sử dụng nồng độ huyết thanh thấp để loại bỏ hầu hết các tế bào tạo máu không bám dính. Hầu hết những tế bào không bám dính như những tế bào tạo máu đều được loại bỏ sau khi thay môi trường, chỉ còn lại những tế bào bám dính là MSC trong các hộp nuôi (Trương Định, 2007).
Huyết  thanh được bổ sung vào môi  trường để  tạo điều kiện  tối ưu cho nuôi cấy tế bào. Thành phần chính yếu có trong huyết thanh là protein. Ngoài ra nó còn chứa  nhiều  polypeptid,  các  nhân  tố  tăng  trưởng,  lipid,  hormone,  amino  acid, glucose, ketoacid và các nguyên tố vi lượng như sắt, đồng, kẽm…

Vai trò của huyết thanh trong nuôi cấy tế bào MSC:
–  Cung cấp chất dinh dưỡng quan  trọng cho  tế bào như amino acid  thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…
–  Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích sự tăng trưởng và phân chia.
–  Kích thích sự phục hồi các tổn thương tế bào khi tách bằng tác dụng lực cơ học hay dùng enzyme mạnh như Trypsin.
–  Bất hoạt Trypsin.
–  Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.
–  Tăng tính bám dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi.
–  Chống oxy hoá.

Tuy  nhiên,  giá  thành  của  huyết  thanh  là  khá  cao  (chiếm  90%  chi  phí môi trường nuôi cấy). Ngoài  ra huyết  thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma. Hiện nay, nhiều nhà nghiên cứu đã và đang xây dựng công thức môi trường nuôi không có huyết thanh (ví dụ như D’MEM F12) hoặc dùng với lượng rất thấp.
Tóm lại, việc nuôi cấy tế bào động vật nói chung cũng như tế bào gốc trung mô thì phức tạp hơn nhiều so với nuôi vi sinh hay tế bào thực vật, vì tế bào động vật rất nhạy cảm với các tác nhân bên ngoài môi trường. Việc nuôi cấy tế bào thì phải tiến hành thay môi trường 2 đến 3 ngày  một lần, tránh để tình trạng cạn kiệt các chất dinh dưỡng làm đổi màu môi trường do thay đổi pH sẽ gây chết tế bào. Chất dinh dưỡng giữ vai trò tối cần thiết trong nuôi cấy tế bào, chúng là nhân tố quyết định sự thất bại hay thành công sự phát triển của tế bào in vitro.

Tài liệu tham khảo
Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2007). Công nghệ Sinh học Người và Động vật. Nhà xuất bản Giáo dục.
Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009). Công nghệ tế bào gốc. Nhà xuất bản Giáo dục
Đặng Thị Tùng Loan. 2007. Thu nhận và biệt hoá tế bào gốc trung mô người từ máu cuống rốn. Luận văn tốt nghiệp cử nhân công nghệ sinh học. Khoa sinh học. Đại học Khoa Học Tự Nhiên.
Trương Định, 2007, Thu nhận và biệt hoá tế bào gốc từ tuỷ xương chuột (Mus musculus var. Albino), Luận văn tốt nghiệp cử nhân công nghệ sinh học. Khoa sinh học. Đại học Khoa Học Tự Nhiên.

Advertisements

Trả lời

Mời bạn điền thông tin vào ô dưới đây hoặc kích vào một biểu tượng để đăng nhập:

WordPress.com Logo

Bạn đang bình luận bằng tài khoản WordPress.com Đăng xuất /  Thay đổi )

Google+ photo

Bạn đang bình luận bằng tài khoản Google+ Đăng xuất /  Thay đổi )

Twitter picture

Bạn đang bình luận bằng tài khoản Twitter Đăng xuất /  Thay đổi )

Facebook photo

Bạn đang bình luận bằng tài khoản Facebook Đăng xuất /  Thay đổi )

w

Connecting to %s